中药单体药理if7+ 海军军医大＆广药大： 隐丹参

　　隐丹参酮(Cryptotanshinone，CPT)是从丹参中提取的一种重要的生物活性成分，具有多种药理活性。然而，CPT对放射性肺纤维化(RILF)的影响尚不清楚。本研究从肠-肺轴角度探讨了CPT对RILF的保护作用，特别关注了胆汁酸(BA)-肠道微生物轴。结果发现，CPT可以抑制上皮-间充质转化(EMT)过程，抑制炎症，减少辐射诱导小鼠肺纤维化的细胞外基质沉积。此外，16S rDNA基因测序和BAs靶向代谢组学分析表明，。CPT显著提高了有益菌属Enterorhabduus和Akkermansia的比例，降低了Erysipelatoclostridium的比例，这与肠道内脱氧胆酸、石胆酸等几种法尼醇X受体(FXR)天然激动剂水平升高有关，激活了FXR通路。综上所述，CPT可以调节辐射引起的小鼠肠道微生物群和BAs代谢的破坏，减轻辐射引起的肺部炎症和纤维化。

　　肺功能进行性丧失和肺组织重塑被认为是肺纤维化的特征。为了验证CPT对RILF组织学改变的影响，小鼠接受25 Gy全胸辐射，然后接受低/高剂量CPT治疗12周(图1a)。PFD是一种多细胞因子，可防止RIPF患者肺功能下降，作为阳性对照。照射后小鼠体重明显下降，第4周CPT组小鼠体重有所改善(图1b)。照射后12周，收集肺标本，进行H&E和Masson染色。H&E染色结果显示，辐射照射后肺组织结构破坏严重，肺泡萎缩，肺泡壁增厚，大量炎症细胞浸润(图1c)。与对照组相比，辐射组马松Masson染色观察到大量蓝色胶原纤维。采用H&E染色的HE评分和Masson染色的Ashcroft评分评估肺损伤和纤维化程度。HE评分和Ashcroft评分显示，CPT(30和60 mg/kg)剂量依赖性地通过减轻炎症和抑制胶原沉积减轻辐射引起的肺组织破坏(图1d，e)。此外，CPT治疗后肺组织中HYP含量明显降低。总之，CPT在60mg /kg剂量下的抗纤维化能力可与PFD在100mg /kg剂量下的抗纤维化能力相当。

　　图1 实验设计与小鼠体重、肺组织分析和羟脯氨酸(HYP)含量。(a)雌性C57BL/6小鼠分为对照组、辐射组(IR)、低剂量CPT组(CPT-L)、高剂量CPT组(CPT-H)和吡非尼酮组(PFD)，分别给予不同的处理，12周后处死小鼠采集样本；(b)各组体重变化情况；(c)肺组织切片具有代表性的H&E染色和Masson染色图像；(d)各组HE染色评分；(e)各组Ashcroft评分；(f)肺组织中HYP的含量。数据以平均值±SEM (n = 5)表示。与对照组相比，**p  0.01；与IR组相比，#p  0.05，##p  0.01。

　　EMT在RILF过程中起着至关重要的作用。肺泡上皮细胞受到辐射损伤后，TGF-β1诱导EMT过程，TGF-β1是强效纤维化的关键因子。在这个转变过程中，肺泡上皮细胞失去上皮标志物，获得间充质标志物，转变为成纤维细胞或肌成纤维细胞，促进ECM，如I型胶原，导致纤维化。本研究证明了辐照后血清中TGF-β1水平升高(图2a)，CPT治疗部分逆转了这种作用。Western blot分析结果显示，与对照组相比，IR组α-SMA和vimentin两种间充质标志物上调，上皮标志物E-cadherin表达下调。免疫组化分析结果也显示，IR组小鼠I型胶原和α-SMA表达明显升高(图2e)。此外，CPT治疗恢复了I型胶原、α-SMA和E-cadherin的表达水平。以上结果表明，CPT能有效抑制EMT的发生。

　　图2 隐丹参酮(CPT)抑制辐射诱导肺纤维化(RILF)小鼠上皮-间充质转化过程。(a)血清中TGF-β1水平(n=5)；肺组织中(b)α-SMA、(c) Vimentin、(d) E-cadherin蛋白表达水平(n=4)；(e)肺组织中I型胶原、α-SMA免疫组化染色代表性结果及面积比(n=3)。数据以平均值±SEM表示。与对照组相比，*p  0.05，**p  0.01；与IR组相比，#p  0.05，##p  0.01。

　　反复的炎症是纤维化的重要触发因素，并且几乎持续整个纤维化过程。为检测CPT对RILF的抗炎作用，采用ELISA法检测各组肺组织TNF-α、IL-1β、IL-6水平。如图3所示，CPT治疗后，IR组升高的TNF-α、IL-1β和IL-6水平明显降低。CPT-H组的抑制效果优于CPT-L组，可与PFD组相媲美。这些结果清楚地表明CPT可以通过抑制炎症来消除RILF。

　　肠道是最大的免疫器官。肠黏膜屏障能有效阻止肠道内细菌、毒素等有害物质进入其他组织以保护宿主免受侵袭，肠黏膜层主要由杯状细胞和紧密连接蛋白如ZO-1、occludin等组成。H&E染色结果显示，RILF小鼠出现结肠损伤，包括广泛可见的黏膜上皮变性，胞浆松弛，固有层淋巴细胞点状浸润(图4a)。免疫组织化学染色进一步显示，ZO-1和occludin蛋白定位于健康肠道上皮细胞膜，但在IR组小鼠中明显减少，这表明RILF可能导致肠黏膜屏障受损。而CPT(60 mg/kg)治疗可通过上调ZO-1和occludin的表达水平，恢复肠道屏障功能，减轻结肠损伤。

　　图4 隐丹参酮(CPT)可减轻小鼠结肠损伤，恢复肠道屏障功能。(a)结肠组织切片H&E染色的代表性图像。比例尺：200 μm。(b)结肠组织ZO-1、occludin免疫组化染色的代表性结果及其面积比。数据以平均值±SEM表示(n = 3)。与对照组相比，*p  0.05，**p  0.01；与IR组相比，#p  0.05。

　　采用16S rDNA测序技术测定肠道菌群组成，稀疏曲线趋于平坦，说明样本数量充足(图5a)。用α多样性和β多样性评估辐射和CPT治疗对肠道微生物群的影响。与对照组相比，IR组Sobs、Chao1、Ace指数均降低(图5b-d)。然而，CPT(60 mg/kg)处理显著增加了肠道微生物的多样性和丰富度。基于Unweighted_unifrac距离的主坐标分析(PCoA)也显示，三组肠道菌群明显分离(图5e)。

　　此外，作者利用LEfSe分析估计了各组从门到属的核心细菌(图7)。通过秩和检验共筛选出56个组间差异显著的属。这些结果表明，CPT对RILF的疗效可能取决于其对肠道微生物群的调节。

　　图6 隐丹参酮(CPT)对肠道菌群组成的影响。(a)科水平肠道菌群的相对丰度和三组显著改变菌群的相对丰度；(b)属水平肠道菌群的相对丰度和三组显著改变菌群的相对丰度。

　　图7 基于16S rDNA相对丰度的肠道菌群组成线性判别分析(LDA)效应大小(LEfSe)分析。(a) LEfSe分析的LDA区分结果表。只显示LDA得分大于3的分类群；(b) LEfSe分析的物种分类学分枝图(Cladogram)。

　　BAs作为宿主代谢的重要参与者，不仅调节肠道内稳态，而且在肠道黏膜屏障中起着至关重要的作用，阻止病原抗原的侵袭。许多研究表明，肠道生态失调和BAs紊乱会损害肠道屏障和免疫力。为了分析CPT治疗如何影响BA代谢，我们使用QTRAP 6500+ LC-MS/MS系统共鉴定了27个BAs水平。与对照组相比，IR组BAs池发生了显著变化(图8a,b)，表明RILF诱导了BAs代谢紊乱。有趣的是，通过CPT (60 mg/kg)处理，总BAs、结合型BAs、非结合型BAs、初级BAs和次级BAs的水平在很大程度上得到了恢复(图8c)。此外，CPT还显著降低了FXR拮抗剂(牛磺-β-鼠胆酸(T-β-MCA))和天然激动剂(脱氧胆酸(DCA)、牛磺酸脱氧胆酸(TDCA)、石胆酸(LCA)、牛磺石胆酸(TLCA)、鹅去氧胆酸(CDCA)、牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)、胆酸(CA)和牛磺胆酸(TCA))的比例(图8d)。该结果表明CPT调控BA稳态，这可能与FXR的激活有关。

　　FXR受体作为BA传感器，在维持BA稳态中起着重要作用。FXR受体在肺中也有表达，与呼吸系统疾病有内在关系。由于CPT给药期间DCA和LCA水平明显升高，我们接下来探讨CPT对肺组织FXR受体的影响。结果表明，CPT治疗上调了FXR的蛋白表达(图8f，g。